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論文解讀--尼羅羅非魚MyD88 基因熒光定量PCR檢測方法的建立

出處:水生動物健康評估公眾號 作者:陸枝 水產養殖網 2019-10-15 23:32:00

髓樣分化因子(myeloiddifferentiation factor 88,MyD88) 是天然免疫反應中一類重要模式識別受體-Toll 樣受體(Toll-like receptors, TLRs)信號通路中的接頭蛋白,是信號向下游傳導的關鍵靶分子。MyD88現已在多個物種中分離鑒定出來,并檢測到其在心、肝、腎、脾、肌肉和血液等組織中普遍表達, MyD88 有著重要的生物學功能。實驗研究選擇實時熒光定量PCR技術作為試驗的技術途徑,以β-actin 基因為內參,建立尼羅羅非魚MyD88熒光實時定量檢測平臺。
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實時定量PCR技術具有靈敏度高、特異性強、簡便快速、安全可靠等優點,已被廣泛應用于動物醫學病理和分子生物學研究領域。在實時定量反應中,起關鍵作用的是能夠散發熒光的探針或染料,它能與dsDNA結合,通過信號收集可以實時展現定量擴增情況。所用熒光染料SYBR GreenⅠ是一種結合于DNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料,可應用于任何反應體系,方法簡便且經濟實惠。由于它可以和任何DNA雙鏈分子結合,因此反應完成后必須進行熔解曲線的測定,以判定是否有非特異性產物和引物二聚體,并據此對引物及反應體系進行優化。
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總RNA的完整性
經紫外分光光度計檢測,RNA樣品A260/A280值均在1.98~2.0 之間。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示(圖1),5 S、18 S和28 S帶型完整,說明樣品沒有發生降解,質量良好,能滿足后續實驗操作的要求。
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擴增結果
目的基因MyD88 和內參基因β-actin 的定量擴增曲線如圖2 所示,均呈典型的S 型,模板濃度越高,CT值越小,隨著擴增循環數的增加,熒光信號逐漸增強,當循環數達到一定程度時,熒光強度達到平臺;MyD88 和β-actin 基因標準曲線CT值檢測范圍分別為24~35 和19~30,均在有效線性范圍區間。
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熔解曲線分析顯示(圖3),MyD88 和β-actin的熔解曲線分別在78.5℃、77.5℃處形成單一的特異峰,熔解溫度均一,且峰位于5℃范圍內,無特異性熒光,PCR反應產物純度好。
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通過4%瓊脂糖凝膠電泳檢測,MyD88 和β-actin基因實時定量PCR 擴增產物分別在約70 bp 和55 bp 處得到單一的擴增條帶。測序結果表明,擴增產物的長度分別為67 bp 和57 bp,核苷酸序列BLAST 檢索證實為尼羅羅非魚MyD88 和β-actin 基因的部分序列。
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從擴增數據結果(表2)來看,除肌肉組織MyD88 表達量極低外(CT 值>35),實驗中測定的MyD88 和β-actin 熒光定量PCR反應CT 值范圍均在15~30 之間,且數值集中;平均CT 標準差小于0.27,變異系數小于1.0%,標準差和變異系數都較小。通過組織定量分析結果來看,健康尼羅羅非魚體內MyD88在肝臟和脾臟中表達量最高,在血液中次之,在肌肉中表達量最低。
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R2 分別為0.998 和0.995,表明標準曲線線性度好,誤差小;E 分別為-3.320 和-3.404,在較好的范圍區間,大大降低了由于擴增效率過低而高估各組織MyD88相對差異的影響。MyD88 和β-actin 基因標準曲線斜率差小于0.1,可認為其擴增效率基本一致,滿足應用2−ΔΔCt進行相對定量分析尼羅羅非魚MyD88表達的條件。

據Pfaffl報道,當實時熒光定量PCR 擴增CT值變異系數小于2.5%時,定量反應結果可靠。在尼羅羅非魚組織相對定量PCR檢測中,MyD88 和β-actin熒光定量PCR 反應平均CT值變異系數小于1.0%,表明所建立的實時檢測MyD88 基因在不同組織中的表達重復性好。

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